MR600D細胞破砕標準ワークフロー

MR600D 細胞破砕標準ワークフロー

1. 目的と原理

細胞破砕は、タンパク質抽出、核酸抽出、酵素活性測定、サイトカイン解析、代謝物解析に必要な基本的な前処理です。MR600D非接触式超音波破砕装置は液相キャビテーションにより均一な微小ジェットとせん断力を発生させ、プローブをサンプルに接触させずに細胞膜と細胞骨格を破砕します。

2. サンプルと試薬条件

• サンプル: 接着細胞、浮遊細胞、初代細胞、幹細胞などの哺乳動物細胞。
• 細胞量: 通常1 x 10^6から1 x 10^7 cells。細胞種と下流測定に応じて調整します。
• バッファー: タンパク質抽出にはRIPA、核酸抽出には無菌裂解バッファー、PBS、必要に応じて新鮮な阻害剤を使用します。
• 装置条件: MR600Dを約20分予冷し、4 C循環水を安定させます。

3. 標準フロー

1. 接着細胞は消化後PBSで洗浄し、浮遊細胞は遠心で回収します。
2. ペレットを200-500 ulの適切な裂解バッファーで懸濁し、氷上で5-10分置きます。
3. 短時間遠心して液体を集め、超音波処理前に気泡を除去します。
4. MR600D 1.5 mlラックにチューブを対称に配置します。
5. 標準条件または穏やかな条件を選び、低温下で処理します。
6. 12000 rpm、4 Cで10分遠心し、上清を下流実験に使用します。

4. 参考条件

サンプル	振幅	パルス	総時間	目標
HEK293、Hela、HepG2などの一般的な細胞株	30%	5 s on / 10 s off	120-180 s	均一な濁りを伴う完全裂解
幹細胞、初代細胞、免疫細胞などの敏感な細胞	30%	3 s on / 7 s off	90-120 s	活性保持を重視した穏やかな裂解

5. QCとトラブル対応

合格したライセートは均一で、目視できる細胞塊や重い沈殿がありません。顕微鏡で完全細胞の残存を確認できます。破砕不足の場合は総時間を延長し、懸濁状態を改善します。過破砕の場合は総時間を短縮し、サンプルをより低温に保ちます。沈殿が出る場合はバッファー適合性を確認し、下流測定前に遠心します。

6. まとめ

MR600Dは低温、非接触、再現性のある細胞破砕方法を提供します。プローブ汚染と局所加熱を抑え、タンパク質、核酸、活性保持を必要とするワークフローに利用できます。