MR300D NGS DNA断片化標準ワークフロー

MR300D NGS DNA断片化標準ワークフロー

1. 目的と適用範囲

DNA断片化はNGSライブラリ調製の重要な前処理です。このワークフローはMR300D超音波DNA断片化装置を用い、ゲノムDNA、cfDNA、プラスミドDNA、微生物DNAに対して再現性のある非接触式断片化条件を整えます。170 bp、350 bp、500 bp、800 bpなどの一般的なライブラリ断片長に対応し、サンプル処理、温度管理、QC、トラブル対応を追跡できるようにします。

2. 装置とサンプル条件

• 装置: 低温循環水システムを備えたMR300D非接触式超音波DNA断片化装置。
• 周辺機器: QubitまたはNanodrop、アガロースゲル電気泳動装置、フラグメントアナライザー、低温遠心機、クリーンベンチ。
• 消耗品: ヌクレアーゼフリー0.5 mlチューブまたはPCR薄壁チューブ、ヌクレアーゼフリー水、NGS溶出バッファー、アイスボックス、チューブラック。
• サンプル基準: Qubit濃度20 ng/ul以上、OD260/280が1.8-2.0程度、OD260/230が2.0-2.2程度、明らかな分解、凍結融解の繰り返し、濁りや沈殿がないこと。

3. 標準フロー

1. 作業台をUV滅菌し、MR300Dと循環水システムを4 Cまで予冷します。
2. DNAを穏やかに混合し、短時間遠心して濃度に応じた100 ul系を調製します。
3. 気泡を除去し、チューブをラックに対称に配置します。必要に応じて空孔をバランスします。
4. 目標断片長に合わせて条件を選択し、非接触式超音波処理を開始します。
5. 処理後に短時間遠心し、氷上で保持して速やかにライブラリ作製またはQCへ進みます。

4. 参考条件

目標断片	振幅	総時間	パルス	用途
170 bp	50%	900 s	15 s on / 15 s off	ターゲットシーケンス、ctDNA
350 bp	30%	600 s	15 s on / 15 s off	標準WGS、WES
500 bp	30%	450 s	15 s on / 15 s off	低深度WGS
800 bp	30%	300 s	15 s on / 15 s off	長めの断片解析、微生物ゲノム

5. QCとトラブル対応

アガロースゲルやフラグメントアナライザーで確認します。合格サンプルはバンドが集中し、高分子残りや強いスメアがなく、主ピークが目標範囲に近い状態です。断片が大きい場合は処理時間を50-100 s延長し、気泡と温度を確認します。断片が小さい場合は振幅または総時間を下げ、サンプルの凍結融解履歴を確認します。

6. まとめ

MR300Dは非接触式超音波処理、4 C温度管理、追跡可能なパラメータ、処理後QCを組み合わせ、NGS DNA断片化を標準化します。方法構築、バッチ処理、日常的なライブラリ調製支援に適しています。