MR600D ChIPクロマチンせん断標準ワークフロー

MR600D ChIPクロマチンせん断ワークフロー

1. 目的と原理

クロマチンせん断はChIP、ChIP-qPCR、ChIP-seqの重要工程です。このワークフローはMR600D非接触式超音波破砕装置を用い、タンパク質-DNA相互作用を保持しながら交聯クロマチンを穏やかで均一に断片化します。一般的な目標範囲は200-1000 bpで、ChIP-seqでは200-500 bp、ChIP-qPCR検証では500-1000 bpが目安です。

2. サンプルと試薬条件

• サンプル: 接着細胞、浮遊細胞、肝臓、腎臓、脳組織などの軟組織。
• 交聯: 1%ホルムアルデヒドで約10分、0.125 Mグリシンで5分停止。
• 細胞量: 1サンプルあたり通常1 x 10^6から5 x 10^6 cells。
• 試薬: SDS lysis buffer、希釈バッファー、PMSF、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ヌクレアーゼフリー水、ヌクレアーゼフリーチューブ。
• 装置条件: MR600Dを4 Cに予冷し、循環水を3 Cから6 Cで安定させます。

3. 標準フロー

1. 交聯停止後、PBSで細胞を2回洗浄します。
2. 新鮮な阻害剤を含む100-500 ul SDS lysis bufferで核沈殿を懸濁します。
3. 氷上で約10分裂解し、気泡を完全に除去します。
4. MR600Dラックにチューブを対称に配置し、エネルギー場を均一にします。
5. 低温循環下で間欠超音波処理を行います。
6. 12000 rpm、4 Cで10分遠心し、上清をせん断済みクロマチンとして回収します。

4. 参考条件

ワークフロー	パルス	総時間	目標範囲	備考
ChIP-seqグレード	15 s on / 15 s off	300-600 s	200-500 bp	高解像度シーケンス向け
ChIP-qPCR検証	15 s on / 15 s off	300-600 s	500-1000 bp	濃縮確認に適用
組織サンプル	15 s on / 15 s off	30-50%延長	組織に依存	温度条件は維持

5. QCと最適化

逆交聯後にアガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで確認します。気泡、過度な交聯、不十分な裂解、不安定な水温を避けます。断片が大きい場合は総時間を延長し、裂解条件を見直します。断片が小さい場合やIPシグナルが弱い場合は、処理時間を下げ、サンプル品質と抗体適合性を確認します。

6. まとめ

MR600Dは低温、非接触、均一なクロマチンせん断を実現し、局所加熱やプローブ汚染を抑えます。ChIP-qPCRの条件検討およびChIP-seqライブラリ調製に適しています。